反相色譜中溶劑效應的表征、原理及解決方法

摘要

本文旨在對高效液相色譜中常見(jiàn)的溶劑效應的現象進(jìn)行分析，探討形成溶劑效應的原理，并提出相應的解決方法，為相關(guān)實(shí)踐提供相應的指南。

一、概述

在紫外-可見(jiàn)分光光度法、高效液相色譜法與氣相色譜法三個(gè)領(lǐng)域中均有“溶劑效應”這一術(shù)語(yǔ)，分別具有不同的意義，由于篇幅有限，本文僅討論高效液相色譜法常用的反相色譜中的溶劑效應，其他如正相色譜、離子色譜、親水作用色譜等可參考本文的分析方法與相關(guān)原理。

二、溶劑效應的概念

目前較為*的對于溶劑效應的理解為稀釋劑溶劑強度大于流動(dòng)相時(shí)造成色譜峰變形的現象。如用純乙腈溶解樣品，注入流動(dòng)相為乙腈-水（18:82）的反相系統中，會(huì )造成峰分叉或拖尾的結果。但是這種概念不能解釋實(shí)踐中其他由稀釋劑導致的色譜行為異?，F象，如溶出曲線(xiàn)研究中pH6.8溶出介質(zhì)的溶出樣品主峰峰型異常、或加入SDS助溶后峰分叉等情況，這些情況中稀釋劑的溶劑強度并不一定大于流動(dòng)相，但是卻發(fā)生了色譜行為異常的現象。

鑒于許多由稀釋劑導致的色譜行為異?，F象不能用目前的溶劑效應進(jìn)行解釋?zhuān)獙⑷軇┬母拍钸M(jìn)行重新闡述：溶劑效應，是指由于供試品中特定組分在稀釋劑與流動(dòng)相中所處狀態(tài)的差異對色譜行為的不利影響。如果這種不利影響較為嚴重，則可能造成明顯的色譜行為異常，如峰分叉、拖尾等。

三、溶劑效應的表征

溶劑效應是一種對色譜行為的不利影響，影響程度不同，色譜行為的表征也各有不同；較輕的影響可能沒(méi)有明顯的色譜行為的異常如無(wú)法觀(guān)察到的峰輕度展寬等，次一級的可能表現為峰明顯展寬、低柱效，較為嚴重表現有特定組分峰保留時(shí)間不穩定、峰型異常、響應值不穩定等。

峰型異常是直觀(guān)也是常見(jiàn)的溶劑效應的表現形式，如峰分叉、拖尾、前沿等。保留時(shí)間不穩定與響應值不穩定也是較為常見(jiàn)的表現形式，可能也會(huì )伴隨峰型異常的情況；較為難以覺(jué)察到的溶劑效應是峰型正常只是響應值波動(dòng)較大的情況，易誤判為儀器故障等系統適用性方面的原因，如方法開(kāi)發(fā)期間發(fā)現峰對稱(chēng)、但柱效較低且連續進(jìn)樣RSD較大，建議評估溶劑效應的風(fēng)險。

溶劑效應具有一定的規律，如保留時(shí)間小的組分峰較易發(fā)生，多組分色譜圖中出峰較晚的組分峰型較好、減少進(jìn)樣量一般可減輕等，在實(shí)踐中可根據該規律對色譜行為異常是否為溶劑效應進(jìn)行初步的判斷。

四、溶劑效應的原理及解決方法

如上文所述，溶劑效應為特定組分在稀釋劑與流動(dòng)相中所處狀態(tài)的差異對色譜行為的不利影響，差異主要包括洗脫能力、電離狀態(tài)、離子締合、互變平衡等。

1 洗脫能力

這是目前一般意義上的理解，即上文提到的“純乙腈溶解樣品，注入流動(dòng)相為乙腈-水（18:82）的反相系統中，會(huì )造成峰分叉或拖尾的結果”。如果稀釋劑的洗脫能力大于流動(dòng)相，則可能導致溶劑效應。

解決方法為調整稀釋劑或流動(dòng)相，使二者的洗脫能力接近或稀釋劑的洗脫能力低于流動(dòng)相。一般情況下，為避免洗脫能力導致的溶劑效應，反相色譜中較為穩妥的做法是稀釋劑中有機相比例低于流動(dòng)相或相當，必要時(shí)可略高于流動(dòng)相，但應當評估其溶劑效應的風(fēng)險，如根據上文提到的規律進(jìn)行判斷等。

2 電離狀態(tài)

藥物活性成分很多都可以離子化，如苯磺酸氨氯地平、青霉素鉀等，這類(lèi)化合物絕大多數不是強電解質(zhì)，只能部分電離；即電離平衡中一部分是離子狀態(tài)另一部分是分子狀態(tài)，兩種狀態(tài)在固定相與流動(dòng)相的分配是不一樣的。在反相系統中，分子狀態(tài)與固定相結合更為緊密，保留更強；離子狀態(tài)則更傾向于流動(dòng)相，保留較弱。

設想一種情況，如果樣品為堿性化合物，稀釋劑為pH6.8緩沖鹽溶液（溶出曲線(xiàn)研究較為常見(jiàn)），流動(dòng)相為pH3.0的磷酸鹽溶液-有機相系統，這有非常大的可能導致明顯峰型異常的溶劑效應。因為樣品在pH6.8緩沖鹽溶液中的電離狀態(tài)遠低于pH3.0的磷酸鹽溶液，供試品溶液與流動(dòng)相混合的過(guò)程中，需要一段時(shí)間將電離狀態(tài)從稀釋劑緩沖至流動(dòng)相的狀態(tài)，如因某些原因（稀釋劑是緩沖鹽、流動(dòng)相緩沖能力弱等）導致該時(shí)間較長(cháng)，則待測組分峰極可能出現明顯的峰型異常。

這種情況出現的溶劑效應解決辦法一般有四種：更換稀釋劑使稀釋劑中待測物的電離狀態(tài)與流動(dòng)相一致或接近，減少進(jìn)樣量、在流動(dòng)相中加入反離子或者增加流動(dòng)相緩沖能力。緩沖能力相關(guān)內容參見(jiàn)拙著(zhù)《方法開(kāi)發(fā)緩沖鹽選擇指導原則》。

3 離子締合

這種情況常見(jiàn)于由于待測物溶解性差在稀釋劑中含有十二烷基硫酸鈉的試驗中，待測組分峰可能?chē)乐刈冃?，或者保留時(shí)間波動(dòng)非常大。如果待測物為堿性化合物，則其原因為離子狀態(tài)的待測物的陽(yáng)離子與十二烷基硫酸根陰離子形成離子締合物，該物質(zhì)在反相色譜中保留相對于待測物極大增強；而在流動(dòng)相中并不存在該締合物，流動(dòng)相消除該締合物的影響時(shí)間如果較長(cháng)，則會(huì )產(chǎn)生明顯的溶劑效應。

簡(jiǎn)單的做法是更換稀釋劑，如稀釋劑不能更換，也可改變流動(dòng)相，如在流動(dòng)相中加入待測物的反離子，也形成離子締合物，減少待測物在稀釋劑與流動(dòng)相中的差異。

4 互變平衡

對于在溶液中存在互變結構的待測物，例如酮式烯醇式互變，如果在稀釋劑與流動(dòng)相中互變異構狀態(tài)差異較大，也可能導致明顯的溶劑效應。

酮式烯醇式互變參見(jiàn)拙著(zhù)《HPLC方法開(kāi)發(fā)需注意的典型特殊結構化合物專(zhuān)題:酮式烯醇式互變》。

5 總結

上述差異導致的溶劑效應，根本原因是待測物在固定相-稀釋劑的分配系數與固定相-流動(dòng)相分配系數的較大差異導致的，是固定相、稀釋劑、流動(dòng)相三方博弈的結果。因此在評估溶劑效應的風(fēng)險時(shí)，應當結合三方的具體情況進(jìn)行分析，對三方互相作用的力度進(jìn)行評估。解決溶劑效應的上文未提到的方法就是改變固定相種類(lèi)，如將C18柱更換為CN柱，因為稀釋劑與流動(dòng)相中狀態(tài)的差異導致的分配系數的差異在CN柱中小于C18柱。

也就是說(shuō)，消除或者減少溶劑效應的影響可以從稀釋劑、流動(dòng)相與固定相三個(gè)方面著(zhù)手，使稀釋劑與流動(dòng)相性質(zhì)接近、減少稀釋劑用量；或者使流動(dòng)相與稀釋劑性質(zhì)接近、增強流動(dòng)相改變待測物狀態(tài)的能力；或者更改固定相種類(lèi)減少待測組分狀態(tài)差異對色譜行為的影響等。

本文沒(méi)有列舉的其他情況也可以按照本文的思維方式對溶劑效應的風(fēng)險進(jìn)行評估。

五、稀釋劑的概念衍生出的一些溶劑效應的特殊情況

本文所述稀釋劑為供試品溶液中除待測物外的所有組分，不能簡(jiǎn)單理解為用來(lái)溶解供試品的溶劑。在進(jìn)行溶劑效應的評估不能只評估待測物在溶解用溶劑中的狀態(tài)與流動(dòng)相中狀態(tài)的差異，而應該結合溶液中其他組分進(jìn)行評估。

在檢測供試品中某些雜質(zhì)的含量時(shí)，特別是高濃度供試品溶液，極可能供試品參與溶劑效應的形成，原理參考上文相關(guān)內容進(jìn)行分析。

有關(guān)物質(zhì)檢測過(guò)程中單獨各組分圖譜峰型正常，混合溶液中出現峰型異常的組分峰也可以理解為其他組分參與了溶劑效應的形成。