液相色譜柱的保養

樣品中強保留物質(zhì)逐漸在色譜柱中積累造成高效液相色譜儀色譜柱的污染，情況嚴重的直接造成色譜柱報廢。為延長(cháng)色譜柱的使用壽命，常用到的方法是色譜柱保護與再生。

高效液相色譜儀色譜柱在色譜分析系統中主要起著(zhù)分離檢測物質(zhì)的作用，如同色譜系

色譜柱在吸附樣品時(shí)，樣品中所含有的鹽、脂質(zhì)、疏水統的心臟，同時(shí)也是易損耗品。

蛋白質(zhì)和其它一些生物物質(zhì)都有可能與色譜柱發(fā)生相互作用，一些保留值較小的物質(zhì)如鹽類(lèi)比較容易被沖出色譜柱，而一些保留性較強的組分，流動(dòng)相溶液不足以把這些物質(zhì)洗脫下來(lái)，多次上樣后，這些吸附在柱子表面的物質(zhì)通常就會(huì )積累在柱頭。

當這些被吸附的樣品成分累積到一定程度足以使之形成新的固定相而改變分離機理，以致樣品保留時(shí)間會(huì )波動(dòng)，會(huì )出現拖尾現象。

色譜柱保護

為了延長(cháng)色譜柱的使用壽命，前面已經(jīng)指出，應在分析柱前連接一個(gè)小體積的保護柱。保護柱是內徑為1.0mm、2.1mm、3.2mm、4.6mm或10mm、20mm、40mm，長(cháng)7.5mm、10mm或20～60mm的短填充柱，通常填充和分析柱相同的填料(固定相)，可看作是分析柱的縮短形式，安裝在分析柱前。

其作用是收集、阻斷來(lái)自進(jìn)樣器的機械和化學(xué)雜質(zhì)，以保護和延長(cháng)分析柱的使用壽命。一只1cm長(cháng)的保護柱就能提供充分的保護作用。若選用較長(cháng)的保護柱，可降低污染物進(jìn)入分析柱的機會(huì )，但會(huì )引起譜帶擴張。因此選擇保護柱的原則是在滿(mǎn)足分離要求的前提下，盡可能選擇對分離樣品保留低的短保護柱。

保護柱也可裝填和分析柱不同的填料，如較粗顆粒的硅膠(10～15um)或聚合物填料，但柱體積不宜過(guò)大，以降低柱外效應的影響。

保護柱裝填的填料較少，價(jià)格較低，其為消耗品，通?？煞治?0～100次樣品，柱壓力降呈現增大的趨向就是需要更換保護柱的信號。

現在市場(chǎng)供應的結構新穎可更換柱芯式設計的保護柱，由保護柱套和可更換式保護柱芯兩部分組成。

對硅膠基體的鍵合固定相，流動(dòng)相的pH值應保持在2.5～7.0之間。具有值的流動(dòng)相會(huì )溶解硅膠，而使鍵合相流失。

使用水溶性流動(dòng)相時(shí)，為防止微生物繁殖引起柱阻塞，應加入0.01％的NAN3，以抑制微生物的繁殖。對不潔凈的樣品，要使用0.45um濾膜過(guò)濾或經(jīng)固相萃取器凈化后再進(jìn)樣。

進(jìn)行正式分析前，應先用10倍柱體積的流動(dòng)相沖洗色譜柱，以保持色譜柱處于平衡狀態(tài)。當使用乙醇、異丙醇、乙酸等黏度大的流動(dòng)相時(shí)，色譜柱的平衡時(shí)間要延長(cháng)，甚至要加倍。

對反相C18鍵合相柱，除去柱中含有的緩沖溶液鹽類(lèi)或水溶性物質(zhì)時(shí)，不應使用純水沖洗。因為C18鍵合相像一條長(cháng)鏈將硅膠黏結，當有有機溶劑存在時(shí)，其表面被流動(dòng)相潤濕，C18長(cháng)鏈*展開(kāi)，像海水中的海藻一樣。當純水或緩沖溶液通過(guò)時(shí)，C18鍵合相與其不浸潤，鍵合相表面會(huì )塌陷，從而將溶劑、樣品分子或無(wú)機鹽分子包合。此時(shí)僅用純水無(wú)法將包合物洗脫出，應使用含5％有機溶劑的水溶液沖洗，才可清除無(wú)機鹽或水溶性物質(zhì)。

硅膠、氧化鋁或正相鍵合相柱，應保存在流動(dòng)相中。氰基柱不能保存在純有機溶劑(如甲醇或乙腈)中，應保留在欲使用的流動(dòng)相中；氨基柱保存在乙腈中，而非流動(dòng)相，并且應注意不可使用丙酮作流動(dòng)相。C18反相柱應保存在純甲醇溶劑中，對填充高交聯(lián)度苯乙烯-二乙烯基苯共聚微球的非極性固定相也可用此法保存。

色譜柱再生

對使用時(shí)間較長(cháng)、柱效逐漸下降的色譜柱，可用下述方法進(jìn)行快速再生，以除去微量不潔雜質(zhì)在柱頭的聚積。

正相柱：用下述極性強且能互溶的有機溶劑來(lái)洗滌色譜柱，每種溶劑每次用30mL清洗，按庚烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮(氨基柱不用)、甲醇、5％甲醇水溶液次序沖洗(洗脫劑的極性依次遞增)，后再用純甲醇通過(guò)柱將水分帶出，拆下柱置于氣相色譜儀柱箱中升溫至75℃，以除去水分。另應注意不能使用乙醇，它會(huì )使柱喪失柱效。

反相柱：用極性溶劑每種30mL，按以下順序清洗：5％甲醇水溶液、0.5mol/L H3PO4(或0.1mol/L EDTA鈉鹽)、5％甲醇水溶液、甲醇、甲醇-三氯甲烷(1：1)混合液、甲醇、5％甲醇水溶液。后保存在甲醇溶劑中。

當色譜柱的性能變得很差時(shí)，可采用下述兩種方法，作后的補救。

一種方法是修補柱頭并同時(shí)更換不銹鋼燒結片。當取下燒結片發(fā)現柱頭塌陷或填料被雜質(zhì)污染時(shí)，可挖掉0.5mm左右的固定相，再重新填充同樣的干燥固定相，用少量流動(dòng)相潤濕，再填充干燥的固定相與柱口平齊(必要時(shí)用光滑的不銹鋼棒壓緊)，如此重復3～5次。

再換上新的不銹鋼燒結過(guò)濾片，擰緊結頭，與高壓泵連接，用流動(dòng)相沖洗20min，若柱壓力降恢復正常，可連接檢測器，測柱效。若柱效恢復就可繼續使用。若柱壓力降恢復正常，但柱效仍偏低，表明柱頭未填充緊密，仍有空隙，此時(shí)應重復上述操作，直至柱壓力降恢復正常、柱效也恢復正常才可繼續使用。

另一種方法是倒沖色譜柱。此法適用于已修補過(guò)柱頭，柱壽命已達中后期的色譜柱。柱逆向使用后柱效會(huì )損失較大(約30％)，倒沖柱可檢查柱頭不銹鋼燒結片是否堵塞。若已堵塞在倒沖柱時(shí)，可觀(guān)察到柱壓力降減小，待柱壓力降恢復正常，再將色譜柱按原方向安裝使用。

柱的使用和維護注意事項

色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會(huì )降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。

在色譜操作過(guò)程中，需要注意下列問(wèn)題，以維護色譜柱：

1、避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì )影響柱內的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會(huì )沖動(dòng)柱內填料，因此在調節流速時(shí)應該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉動(dòng)不能過(guò)緩。

2、應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然，流?dòng)相使用前必須經(jīng)脫氣和過(guò)濾處理。

3、一般說(shuō)來(lái)色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì )迅速降低柱效。

4、選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解，壓力升高是需要更換預柱的信號。

5、避免將基質(zhì)復雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內，需要對樣品進(jìn)行預處 理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經(jīng)常更換。

6、經(jīng)常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí)，對流路系統中流動(dòng)相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過(guò)渡，每種流動(dòng)相的體積應是柱體積的20倍左右，即常規分析需要50～75ml。

7、避免使用高粘度的溶劑作為流動(dòng)相；如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相，應在實(shí)驗完畢柱子沖洗干凈。

8、進(jìn)樣樣品要提純。 

9、嚴格控制進(jìn)樣量，不要超載。

10、每天分析測定結束后，都要用適當的溶劑來(lái)清洗柱，推薦使用洗脫能力強的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線(xiàn)平衡。當采用鹽緩沖溶液作流動(dòng)相時(shí)，使用完后應用無(wú)鹽流動(dòng)相沖洗。含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能會(huì )腐蝕不銹鋼管道，不宜長(cháng)期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使用，應每隔4~5天開(kāi)機沖洗15分鐘。

11、大多數反相色譜柱的pH穩定范圍是2－7.5，盡量不超過(guò)該色譜柱的pH范圍。

12、按說(shuō)明書(shū)保存色譜柱，禁止將緩沖液留在柱內過(guò)夜，注意反相柱不能用純水長(cháng)時(shí)間沖。

13、不建議拆開(kāi)柱子，自己更換填料。